1 - Conceito
O nosso organismo possui mecanismos de defesa que podem ser diferenciados quanto a sua especificidade, ou seja, existem os específicos contra o antígeno ("corpo estranho") e os inespecíficos que protegem o corpo de qualquer material ou microorganismo estranho, sem que este seja específico.
O organismo possui barreiras naturais que são obviamente inespecíficas, como a da pele (queratina, lipídios e ácidos graxos), a saliva, o ácido clorídrico do estômago, o pH da vagina, a cera do ouvido externo, muco presente nas mucosas e no trato respiratório, cílios do epitélio respiratório, e outros.
No trato respiratórios temos o muco como o principal protetor e os cílios que impulsionam o conteúdo para fora. O pili da Neisseria gonorrhae, fímbrias dos Streptococcus, E. coli e das Pseudomonas é capaz de aderir na parede no epítélio da mucosa. A mucosa tem a capacidade de produzir IgA que impede a fixação de bactérias na parede das mucosas. As bactérias quando atingem a mucosa são levados pela via linfática até os linfonodos, que impede a propagação da infecção pelo organismo. Todo esse mecanismo de defesa relacionado ao trato respiratório pode ser deprimido ou até abolido se o indivíduo consome de modo crônico: álcool, drogas ou cigarro. No fumante crônico pode haver uma metaplasia no epitélio respiratório, formando um epitélio estratificado pavimentoso e sem cílios. Este epitélio se formando nos bronquíolos, vão levar retenção de secreção freqüente, o que provoca tosse e infecção repetitiva. Se a obstrução dos bronquíolos forem mais generalizadas devido ao crescimento deste epitélio ( devido ao cigarro), desenvolve-se com o passar dos anos o enfisema pulmonar, uma forma de DPOC grave, que é irreversível e que pode levar a morte por insuficiência respiratória. O enfisema se desenvolve porque o ar que a pessoa inspira com facilidade não consegue sair, ficando preso nos alvéolos. Isto "arrebenta" a parede dos alvéolos e aumenta o ar retido nos pulmões, diminuindo a troca de gases e a renovação do oxigênio. Quanto mais se fuma, mais se retira a defesa dos pulmões. O uso do cigarro é uma prática suicida e criminosa, pois afeta também pessoas ao redor ( fumante passivo), que podem sofrer os mesmos males.
O mecanismo de reflexo da tosse é também um mecanismo de defesa natural inespecífica porque remove agentes irritantes que cheguem às vias aérias inferiores. Esse reflexo é conduzido pelo nervo vago até o bulbo, onde é gerado o reflexo de inspiração e expiração (diafragma e músculos intercostais) e de contração dos músculos da laringe para realizar a tosse. O reflexo de espirro é quase semelhante ao da tosse, porém a via aferente vem das terminações nervoras do nariz.
| A RIC é responsável por diversos fenômenos imunológicos importantes: |
- Reação de hipersensibilidade retardada (tipo IV), como o que ocorre no teste tipo PPD usado para testar o nível de resposta do indivíduo ao agente (como o M. tuberculosis); |
Existem, além das barreiras naturais, respostas imunes inespecíficas que se desenvolvem para combater qualquer invasor que se atreva a penetrar nas barreiras naturais e infectar o organismo. Neste tipo de resposta está presente as células como o macrófago, neutrófilo e eosinófilo, células NK e o complemento. A fagocitose está detalhada adiante neste capítulo e não é específica, mas pode até ser considerada específica do ponto de vista da opsionisação, quer dizer, se a bactéria em questão estiver envolvida por anticorpos específicos que foram produzidos pela resposta imune humoral (específica), os macrófagos irão fagocitar com grande eficiência.
O complemento é o sistema de proteínas encontradas no sangue que possui diversas funções como opsionização, quimiotaxia e lise das paredes celulares. É sistema de combate de maior eficiência contra microorganismo encontrado no nosso organismo.
A maioria das parasitoses, células tumorais e células infectadas por vírus são combatidas principalmente por resposta mediada por células. Devemos deixar bem claro, que resposta mediada por células não quer dizer que não haja participação dos anticorpos. O anticorpos são de grande importância para a fagocitose e para a ativação ou fixação do complemento. A fixação do complemento vai liberar substâncias quimiotáxicas que vão estimular e direcionar as células para o local de ação e agir a sua citotoxidade (RIC). Na resposta mediada por anticorpos ou imune humoral , diferenciando da RIC, os anticorpos é que realizam a neutralização da substância, e neste neste caso ,é a resposta que visa principalmente a produção de imunoglobulinas específicas para as suas diversas funções.
A resposta imunológica mediada por células T citotóxicas possui etapas, que se iniciam com o contato do antígeno com a célula apresentadora de antígeno do sistema monocítico fagocitário. Mas a RIC mediada por macrófagos ou pelos PMN’s se inicia pelo contato das substâncias quimiotáxicas com esses fagócitos, que chegando ao local irão emitir pseudópodes e englobar a partícula, para em seguida realizar a digestão intracelular. Se o antígeno for grande demais, terá a participação de células gigantes multinucelares que irão digerir o antígeno, podendo formar os granulomas.
As células NK são células citolíticas que não necessitam de apresentação de antígenos e não são produzidas na forma de clones específicos. Essas células agem na chamada resposta imune inespecífica, assim como os polimorfonucleares. Resposta inespecífica significa aquela resposta em que não há um combate contra um epítopo, mas sim contra um antígeno que estiver no local, não sendo ele específico, mas qualquer substância estranha que esteja em contato com ele (como uma célula envolvida por imunoglobulina ou célula tumoral).
Neste capítulo iremos detalhar o mecanismo estimulatório dessas células, o mecanismo de ação contra os antígeno e o controle desta resposta imune celular. Em seguida vamos descrever passo a passo a resposta imune celular que ocorre nos macrófagos e nos PMN’s.
2. - Resposta imune celular inespecífica
2.1 - Atividade dos macrófagos e dos polimorfonucleares (PMN’s):
Os macrófagos são células que derivam da migração dos monócitos sangüíneos para o tecido. As suas características morfológicas e bioquímicas são descritas no capítulo referente às células do sistema imune, e posteriormente abordaremos novamente a função das enzimas hidrolíticas.
A função dos macrófagos se baseia principalmente na fagocitose. Fagocitose significa “ ingestão de alimento”, fagócito significa “célula que come” e macrófago “célula grande que come”. Os macrófagos sendo fagócitos, irão se aproximar do antígeno e identificar se essa substância é um antígeno ou não, assim como um animal cheira um material e verifica se ele é um alimento ou não. Se essa substância tem um peso molecular grande, não faz parte do mapa genético do organismo (que o macrófago tem) ou é uma substância de grande complexidade molecular, ele irá fagocitar, porém com uma maior lerdeza e dificuldade. Entretanto, se esta substância estiver envolvida por um anticorpo (IgG p. exemplo), o macrófago irá identificar mais rapidamente que essa substância é um antígeno, e irá fagocitá-la imediatamente. Por que isto ocorre? Devemos nos lembrar no que foi dito no capítulo sobre células do sistema imune a respeito dos receptores de membrana dos macrófagos. Neste capítulo falamos a respeito do FCgamaR é o receptor de imunoglobulina na membrana dos fagócitos. Então,podemos concluir que: quando a imunoglobulina (envolvendo o antígeno) se ligar ao FCgamaR, irá desencadear uma série de reações químicas dentro do macrófago, fazendo-o acreditar que a substância é um antígeno verdadeiro, e então realizará rapidamente a emissão de pseudópodes (englobamento).
Após o englobamento do antígeno, formará uma vesícula chamada de fagossoma e fica envolvido dentro do citossol. Os lisossomas que estão soltos no citoplasma contém enzimas hidrolíticas que estão inativadas pelo pH relativamente alto. O fagossoma se une ao lisossoma e forma o fagolisossoma. O pH no fagolisossoma abaixa, devido a entrada de prótons que vem do citoplasma. Essa acidez ativa as enzimas hidrolíticas que vão despedaçar o antígeno. Se o antígeno for uma bactéria, a morte é devido a ação de radicais livres derivados do oxigênio, como o superóxido, o peróxido de hidrogênio ou radical hidroxila que podem oxidar a membrana da bactéria. Dentre as enzimas hidrolíticas encontramos a fosfatase ácida e a lisozima. Esta última quebra a parede celular de peptidoglicano das bactérias gram positivas. Essa degradação ocorrida dentro do fagolisossoma é chamada de digestão intracelular. É de grande importância que saibamos que o interferon gama é uma citocina que vai estimular eficientemente a fusão do fagossoma com o lisossoma e é produzido por linfóticos T helper. O INF-gama tem a função de estimular a fagocitose através desse mecanismo e também de estimular a expressão do MHC classe II. Obs:. O interferon gama possui inúmeras funções em outras células, e não exclusivamente nos macrófagos. Os aminoácidos, açucares monossacarídeos, íons, ATP e outras substâncias aproveitáveis saem pela membrana da vesícula. Porém os peptídeos determinantes antigênicos (epítopos) são levados à superfície para se unir ao MHC classe II.Mas sobram determinados elementos sem importância para a célula ou indigerível que irão continuar dentro do fagolisossoma. Esta vesícula passa a se chamar de corpo residual e pode ser eliminado da células por exocitose.
Na resposta imune específica ocorrida em macrófagos, a vesícula com o antígeno irá sofrer a digestão intracelular, mas na vesícula irá permanecer um grupo de moléculas ( peptídeos) que se irão desencadear a resposta específica. Cada peptídeo desse é chamado de epítopo ou determinante antigênico e normalmente é formado pela união de quatro aminoácidos. Um antígeno possui diversos epítopos que irão ser apresentados aos linfócitos. Esses epítopos da vesícula serão levados a membrana do macrófago e cada um se ligará lateralmente ao MHC-II para entrar em contato com o linfócitos T helper. Os LTh ativados sofrem a expansão clonal de LT específicos para cada tipo de epítopo. Irão formar também células T específicas de memória para guardar a informação do epítopo (para a resposta imune secundária).
O macrófago ativado ou outra célula apresentadora de antígeno inicia a produção e a exocitose de interleucina 1 (IL-1), que vai estimular os LT helpers a aumentar o seu metabolismo interno e produzir citocinas (interleucinas e interferon). O linfócitos T helper em grande número irá produzir o interferon gama que, além de ativar a fagocitose, irá ativar a expressão do MHC-classe II nos macrófagos. O MHC (Major histocompatibility complex) é o complexo de histocompatibilidade principal, que irá identificar e se ligar aos mais linfócitos T helpers (CD4).
O MHC é composto de 2 cadeias polipeptídicas (uma pesada (beta) e uma leve (alfa)) que possuem regiões glicídicas. Essas cadeias são expressas na membrana celular do macrófago e de outras células apresentadoras de antígeno, com exceção das células dendríticas dos linfonodos. Ele é expresso na mesma hora que ela é sintetizado. A síntese do MHC classe II é feita da seguinte forma:
O macrófago em contato com o interferon gama, irá ativar a transcrição do gene HLA-D em RNA-mensageiro para o MHC classe II. O RNA vai ao retículo endoplasmático (REG) e é traduzido em polipeptídeos. Ainda no REG, as cadeias alfa e beta são interligadas e formam o esqueleto básico do MHC. No REG também são acrescentados oligossacarídeos, que são convertidos a formas mais complexas no complexo de Golgi. Quando termina a síntese do MHC, ele é levado por transporte vesicular até a superfície da célula. O gene HLA está presente na sua maioria no braço curto do cromossoma 6.
O MHC-classe II é um antígeno próprio dos macrófagos que quando expresso, irá se ligar aos linfócitos T helpers que indicará ao SI que o organismo está sendo atacado por antígenos invasores (materiais estranhos). O CD4 é o receptor de MHC-classe II presente nos LTh que faz a ligação das células T com os macrófagos . Quando o linfócitos T helper se liga ao macrófago ( ligação CD4-MHC2) o antígeno ligado lateralmente ao MHC2 é apresentado pelos macrófagos e reconhecido pelo TCR, que é um receptor presente em todos os linfócitos T, e que desencadeia um processo de reações químicos que resultam na ativação dos linfócitos Thelper. Eles irão aumentar o metabolismo, e sofrer a expansão clonal específica ,sob estímulo da IL-2, formando uma população enorme de linfócitos T helpers específicos. A partir daí, os linfócitos T irão desencadear a resposta imunológica específica celular ou humoral ou ambos dependendo do antígeno. Todo esse mecanismo está ilustrado na figura 1.1 para ajudá-lo a ter melhor compreensão.
Fig. 1.1 - Este esquema demostra o processo da fagocitose (resposta imune inespecífica) contra o antígeno vermelho, e os processos da digestão intracelular. A fagocitose é opsionizada (facilitada) pelo C3b(complemento) e IgG. Da digestão do fagolisossoma sai uma vesícula contendo peptídeos (epítopos) que é levada a superfície do macrófago e apresentada ao linfócito T helper-1. Cada epítopo se liga a a um LThelper, no receptor TCR, que vai ativar o linfócito (unido ao CD3). O MHC-II se liga ao CD4. O macrófago ativado vai liberar IL-1 (co-estimulador ) que vai ativar os LT helpers, que vão produzir e liberar a IL-2, que estimula a expansão clonal (proliferação) dos linfócitos juntamente com o interferon gama (IFN-gama) que vai estimular a fagocitose e também é capaz de ativar o mecanismo de transcrição do gene HLA-D que é o gene do MHC-classse II. Os linfócitos T citotóxicos intensamente estimulados pelo IFN-gama e IL-2 farão a RIC (resposta imune celular) específica. Os LTc ativos e proliferados vão reconhecer o MHC-1 estranho presente em células rejeitadas, tumorais ou infectadas por vírus e causar a morte (lise celular) destes.
Devemos destacar também que, existem moléculas de adesão no macrófago que o ajuda na ligação com os linfócitos T helpers na hora de apresentar o antígeno. O ICAM-1 e LFA-3 são moléculas de adesão que se ligam ao LFA-1 e CD 2 respectivamente na membrana dos linfócitos T helpers. Esse mecanismo reforça a ligação do CD4 com o MHC-classe II.
Os neutrófilos são células polimorfonucleares, ou seja, com o núcleo dividido em lóbulos (3, 4 ou 5 lóbulos) e são fagócitos profissionais. Os neutrófilos foram descritos no capítulo de cels. do sistema imune e merece um destaque neste capítulo referente a sua função como fagócito.
Os neutrófilos realizam a fagocitose da mesma forma que o macrófago, sendo também opsionisada pelo C3b do complemento e IgG. O maior quimiotáxico (atrai) para os neutrófilos é o componente C5a do complemento. O C5a se a liga a seu receptor e ativa no neutrófilo um mecanismo que leva a um aumento do seu metabolismo e hipertrofia. O neutrófilo passa a consumir mais oxigênio e tem mais capacidade de fagocitar e de fazer digestão intracelular. Outro quimitáxico importante é o fator quimiotáxico dos neutrófilos liberados pelo mastócito ou basófilo na reação anafilática.Obs: O interferom gama não interfere nos neutrófilos.
O neutrófilos não é uma célula apresentadora de antígenos, sendo responsável apenas pela fagocitose, principalmente de bactérias revestidadas de anticorpos IgG ou C3b e participa ativamente em grande número nas inflamação agudas e é responsável 80 % para formação do pus.
O principal mecanismo de morte celular usado na digestão intracelular é o sistema mieloperoxidase-hialida, no qual o neutrófilo forma radicais HOCl- que oxida intensamente as moléculas do microorganismo fagocitado.
A presença de colagenase e fosfatases ácidas em seus grânulos é que faz o neutrófilo ser uma célula que forma abscessos cheios de pus nas inflamações agudas. Quando eles morrem em combate e suas membranas se rompem, essas enzimas vão para o meio externo, digerindo o tecido conjuntivo e formando o abscesso onde se deposita o pus.
2.2 Atividade dos eosinófilos
Um resposta mediada por célula contra parasitas como os helmintos (tenia, ancylostoma, ascaris...) é feito principalmente por eosinófilos. Os eosinófilos chegam ao local de ação dirigidos pelo ECF-A liberado pelos mastócitos ou basófilos ativados por vários mecanismos , sobretudo pela IgE. Os eosinófilos liberam a PBM (proteína básica maior) que intoxica os parasitas e causa a sua morte. Os antígenos liberados pelos parasitas também causam RIC específicos (mediado por linfócitos T) e RIH para produção de anticorpos principalmente IgE. Da mesma forma são produzidos IgG ou IgM contra os antígenos dos parasitas.
Os mastócitos controlam a desgranulação dos eosinófilos, sendo a heparina o inibidor e o ECF-A o estimulador da desgranulação. Os macrófagos ativados secretam FNT-alfa ( fator necrosante de tumor) que é uma citocina que aumenta a ativação dos próprios macrófagos e dos eosinófilos.
Outra resposta imune celular importante dos eosinófilos é quando o organismo está sofrendo um processo alérgico (hipersensibilidade do tipo I ou anafilática).
Este processo foi descrito no capítulo referente a céls. do sistema imune e foi dito que ocorre uma intensa desgranulação dos mastócitos, liberando SRS-A, histamina, EFC-A, prostaglandinas, bradicinina, etc. Essas substâncias são responsáveis pelos fenômenos que aparecem no paciente. Os eosinófilos entram nessa história para tentar solucionar o problema e reestabelecendo estado de normalidade. O EFC-A liberado os atrai até o local, onde vão liberar histaminase e aril sulfatase B e outras enzimas que vão hidrolisar os mediadores, e com isso diminuir seus efeitos sobre o organismo.
2.3 Inflamação granulomatosa e as células gigantes
Inflamação crônica granulomatosa é uma forma de inflamação específica caracterizada pelo acúmulos de macrófagos modificados, células gigantes que se organizam em torno de um flogógeno (agente causador) formando granulomas. O estímulo para formação desses granulomas tem origem nos agentes etiológicos característicos, como: Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium leprae; treponema pallidum; Schistossoma mansoni (ovos principalente); Criptococcus neoformans; Paracoccidioides brasiliensis; Coccidioides immitis; metais inorgânicos e poeiras como silício e berílio. As doenças causadas por esses agentes são chamadas de doenças crônicas granulomatosas.
Granulomas são pequenas coleções, de 0,5 a 0,2 mm de macrófagos modificados, chamados de células epitelióides, tendo origem nos monócitos que saem do sangue. Essas células tem uma maior função secretora de enzimas em vez de fagocitose, e por isso possuem o retículo endoplamático rugoso, complexo de Golgi desenvolvidos e muitas vesículas no citoplasma. Possuem esse nome por terem o aspecto morfológico parecido com células epiteliais. Na tuberculose, as enzimas liberadas pelas céls. epitelióides acabam digerindo parte do parênquima e essas células ainda criam uma barreia para a difusão de glicose e oxigênio o que acaba causando uma necrose no centro do tubérculo. Essa necrose caseosa (semelhante a queijo ) presente na tuberculose ajuda a distinguí-la das outras doenças granulomatosas.
Uma importante característica dos granulomas é a presença de um tipo especial de célula multinucleada denominada de célula gigante, que se origina dos macrófagos e tem grande capacidade de fagocitose e digestão intracelular. O macrófago faz a divisão nuclear várias vezes sem dividir o citoplasma e aumenta o tamanho da célula. Na esquistosomosse crônica observamos ovos de Schistosoma dentro dessas células no fígado e nas blastomicoses também vemos os fungos dentro do citoplasma sofrendo digestão. Existem vários padrões de células gigantes:
- células gigantes de Langhans - são células que aparecem nos granulomas formados contra agentes infecciosos (tuberculose...), e estruturalmente consiste em uma célula grande com os núcleos ao redor da periferia e um polo da célula contendo um aglomerado (fig.1.2);
- células gigantes do tipo corpo estranho - são células gigantes formadas contra determinados agentes exógenos não-vivos como partículas de poeira, silício, berílio e outros materiais. Essas substâncias são indigeríveis e por isso desencadeiam a formação das células gigantes que vão tentar removê-las do local. Estruturalmente são diferentes das Langhans por terem núcleo mais numerosos ( mais de cem) e expalhados por todo o citoplasma.(fig.1.2);
- células gigantes de Touton - são associadas a doenças de degeneração da gordura, possuem o citoplasma espumoso e os núcleos estão alinhados de forma ondulada no citoplasma;
- células gigantes do sarampo - também são chamadas de células Warthin-Finkeldey, está associado ao sarampo. Elas são encontradas nos tecidos linfáticos e com mais freqüência no apêndice de crianças no estágio de pródromo do sarampo. Estruturalmente são semelhantes as células de Langhans, porém os núcleos são maiores e ocupam mais o citoplasma que a periferia.
Fig. 1.2 - A figura superior à esquerda mostra uma cél. gigante tipo corpo estranho circundado por diversas céls. epitelióides (citoplasma branco) e na figura inferior à esquerda vemos uma cél. gigante de Langhans encontrado em doenças infecciosas e observe sua estrutra com os núcleos na periferia e um polo aglomerado. A figura inferior mostra uma área altamente acidófila (necrosada) encontrada nos tubérculos da tuberculose. Circundando essa área, vemos um aglomerado de céls. epitelióides e linfócitos T.
O processo de formação das células que compõem o granuloma será agora demonstrado:
Quando o antígeno atinge o local, ele estimula uma resposta imune celular. Ocorre a apresentação do antígeno ao linfócito T helper (LTh) que vai ,então secretar citocinas que estimulam mais LTh. Os LTh-1 secretam interferon gama e os LTh-2 secretam a interleucina 4. Essas interleucinas estimulam os monócitos que chegam da circulação a mudarem sua estrutura e se transformar em células epitelióides. Essas citocinas estimulam também o macrófago para formar a célula gigante do granuloma. As citocinas apenas potencializam essas transformações e ainda não se sabe o mecanismo exato para estimular as mudanças funcionais e estruturais nos monócitos e macrófagos para formarem as células do granuloma e sabemos que os linfócitos T tem uma grande participação através dessas citocinas.
3 - Resposta imune celular específica
3.1 - Mecanismo de ação e atividade dos linfócitos na respostam imune celular (RIC)
Com maior detalhes a respeito da ativação dos LThelpers, devemos conhecer o mecanismo molecular de ativação intrínseca do linfócito que está esquematizado na figura 1.3.
Fig. 1.3 - Este esquema demostra as reações químicas no citoplasma e no núcleo de um linfócito Th ativado. O TCR reconhece o antígeno e dispara a cascata de reações que no final geram o 1o sinal e estimula a exocitose. O receptor de IL-1 (do LTh) dispara o 2o sinal para que o 1o sinal tenha efeito. Esse efeito se resume na produção de proteínas , como as citosinas IL-2, INF-gama...). Essa IL-2 sendo autócrina estimula o receptor R-IL2 ( expresso sob influência do TCR) que vai emitir sinais para aumentar a mitose e crescimento celular (expansão clonal) . O R-IL2 está presente também em grande número nos linfócitos T citotóxicos com a mesma função.
Para o TCR ( receptor do linfócito T) ficar exposto na superfície da célula, é necessário a presença do CD3, que é formado por um conjunto de 5 polipeptídeos. Quando o TCR unido ao CD3 se combina com o antígeno, o CD3 envia sinais de ativação para o citoplasma. Esse sinal é feito através da ativação da fosforilação pelo GTP (guanosina trifosfato). O complexo TCR:CD3 ativado faz com que o GTP transfira um radical fosfato para os aminoácidos tirosina dos polipeptídeos do CD3, que estando fosforilado vai ativar a enzima fosfolipase C. Essa enzima hidroliza o PIP2 (4,5-bifosfato de fostatidil-inositol) em IP3 (trifosfato de inositol) e DAG (diacil glicerol). O IP3 estimula a liberação do cálcio das reservas intracitoplasmaticas para o citoplasma. O Ca+2 agora livre no citoplasma vai ativar várias enzimas quinases, que retiram um fosfato do ATP e põem em proteínas. As proteínas fosforiladas vão o núcleo do linfócito e ativam a transcrição do RNA mensageiro para a síntese de interleucinas, como a IL-2 p. exemplo. O DAG ativa proteína fosfoquinase C, que em presença de cálcio livre, fica ativada. A enzima fosfoquinase C (PKC) faz fosforilação de proteínas igual ao IP3. Essas fosfoproteínas vão ao núcleo e estimulam transcrição de genes. Oncogenes (genes de cresimento celular e mitose) são também estimulados à transcrição (como na expansão clonal). A PKC faz também a fosforilação de proteínas de liberação das vesículas, que vão liberar as interleucinas para o meio externo. Essas interleucinas vão estimular a RIC ou a RIH (resposta imune humoral).Todo esse mecanismo que causa ativação de genes vindo da interação TCR-CD3-epítopo é chamado de 1º sinal.
A interleucina 1 é um co-estimulador. Ele estimula um segundo sinal mensageiro intracelular que é indispensável para a ativação dos LThelpers. Esse sinal ainda não esclarecido quando a sua natureza resulta na ativação da transcrição de genes para citosinas (como p.ex. a interleucina 2). Temos como conclusão que o linfócito necessita de 2 sinais para a sua ativação: o primeiro sinal vindo a interação TCR:CD3-antígeno e o segundo sinal vindo do co-estimulador IL-1.
A Interleucina 2 formada é uma substância autócrina, que age sobre o próprio linfócito T helper que a produziu e quando liberada também age nos linfócitos T citotóxicos. É chamada de fator de proliferação, pois estimula a mitose. Quando o complexo TCR:CD3 é ativado pelo antígeno ele estimula a transcrição do gene do receptor de interleucina 2 e a expressão desse receptor na superfície da célula. Quando a IL-2 se liga a esse receptor, ocorre ativação de vários mensageiros intracelulares (desconhecidos) que leva a uma maior ativação da síntese DNA (replicação do DNA), o que propicia a mitose aumentada. Então quando os linfócitos entram em contato com a IL-2, ocorre a expansão clonal (ou seja, uma proliferação de LT específicos que vieram de um só (clone)) do LT helper que a produziu, e expansão do LT citotóxico para a RIC. O gene para IL-2 é ativado para transcrição sob o estímulo de proteínas fosforiladas no citoplasma como foi descrito antes. A ciclosporina é um imunossupressor que inibe essa ativação da transcrição, inibindo a produção de IL-2, o que indiretamente inibe a proliferação dos linfócitos T helper e principalmente os LTcitotóxicos, inibindo a RIC.
Os linfócitos T citotóxicos (LTc) são as células que são capazes de lisar células estranhas, ou infectadas por vírus e também destróem os vírus diretamente. As células estranhas podem ser células tumorais, células de outro indivíduo (aloenxerto), células que expõe na sua superfície o antígeno capsular de vírus, ou fungos...
O reconhecimento das células rejeitadas num enxerto pelos linfócitos T citotóxicos se faz pelo reconhecimento do MHC-classe I. O MHC-classe I é o antígeno de histocompatibilidade principal e está presente na membrana celular de quase todas as células do organismo, exceto em hemácias e plaquetas. É uma glicoproteína que possui duas cadeias , uma cadeia alfa e uma beta. A parte lateral do MHC-classe-1 possui uma estrutura espacial que se encaixa com o CD8 presente nos linfócitos T citotóxicos. O MHC possui uma seqüência de aminoácidos própria para cada indivíduo e se apresenta semelhante para todas as células do organismo. O MHC-1 da células de um indivíduo só é igual ao outro se eles forem gêmeos univitelinos.
A seqüência de aminoácidos presente nas cadeias do MHC estando alteradas na superfície da célula é reconhecida pelo linfócito T citotóxico através da interação com o receptor TCR e CD8. Peptídeo de proteínas endógenas virais produzidas por uma célula infectada será unida em cima da cadeia de aminoácidos de MHC-1 no citoplasma e será levada à superfície da célula. Então o MHC-1 terá na sua ponta uma seqüência de aminoácidos estranha (inválida). Esse MHC-1 alterado é, então, reconhecido pelo LTc. (Veja fig.1.4).
O MHC-I possui um nível de expressão leve, e provém da tradução de RNA-m que foram transcritos por genes HLA-A, HLA-B e HLA-C (cromossoma 6). A expressão desse gene é levada a um nível alto se for estimulada por IFN-gama liberada pelos LT-helper-1 ativados numa infecção.
Mecanismo de rejeição:
Quando um tecido estranho chega ao nosso organismo, partes dele (algumas células do tecido) se desprendem e são levados aos tecidos linfóides secundários, como os linfonodos e/ou baço, onde as células apresentadoras de antígenos apresentam o antígeno ao LThelper (item anterior) .Como foi visto na figura 1.1, os linfócitos T citotóxicos são altamente estimulados pela interleucina 2 e interferon gama que vem dos linfócitos T helper 1 ativados. Estas interleucinas estimulam a expansão clonal dos linfócitos T citotóxicos e a sua ativação para o ataque (veja ítem 3.2).
Ocorre também uma apresentação direta do antígeno ao linfócitos T citotóxicos através do reconhecimento do MHC-classe I estranho na superfície das células estranhas do enxerto, através da interação MHC-1 e TCR (figura 1.4).
Esses linfócitos T citotóxicos possuem receptores CD8 e TCR. O TCR e o CD8 próprio do LTc é capaz de reconhecer o MHC-I que possui uma seqüência de aminoácidos estranha que está presente nas células. Observe que expressão desses MHC-classe I está aumentada, visto que o IFN-gama (seu estimulante) também está aumentado. Após o reconhecimento, ocorre lise do tecido estranho pelas células citotóxicas. No endotélio estranho que compõem o tecido enxertado, é expresso o MHC-classe II, que é reconhecido pelos LT-helpers que chegam ao local e que induzem ainda mais a resposta contra o tecido. Os LT-helpers ativados nos tecidos linfóides e diretamente no local (como os endotélios) podem ativar a resposta imune humoral, que forma anticorpos antienxertos.
Esse mecanismo de rejeição ocorre da mesma forma para células neoplásicas (tumorais), pois possuem alterações nos seus MHC-1 ( receptores neoformados)
Fig. 1.4 - A. Esquema que demostra o mecanismo de rejeição a uma tecido estranho e a importância do MHC-1. B. esquema do o processo de reconhecimento do MHC-1 de uma célula infectada por um vírus. Os peptídeos virais em vermelho são formados por ribossomos da própria célula e se origina de RNA-mensageiro viral que esta parasitando a célula. Veja a importância do INF-gama e da IL-2 na expansão e na ativação dos LTc para o ataque.
RIC (Resposta Imune Celular) contra vírus:
Na RIC que se desenvolve contra vírus e outros, ocorre a migração destes até os linfonodos satélites. Da mesma forma há a apresentação do antígeno pelos macrófagos aos LT helper-1, que fazem uma expansão clonal formando uma imensa população. Nesta expansão, formam-se também células T de memória que vão “guardar” dentro de si as informações sobre o antígeno. Essas informações servem para a resposta imune secundária, na qual o antígeno entra em contato com o sistema pela segunda vez e é rapidamente reconhecido (por células que memória) e atacado (veja ítem 3.3).
Estes LTh-1 da população clonal formam IL-2 e IFN-gama que ativam os LT-citolíticos ou citotóxicos, que vão aumentar o nível da expansão clonal deles e elevar o seu metabolismo interno.
Mas o que ocorre numa infecção por vírus, além da apresentação do antígeno aos LT-helpers, é a apresentação direta aos LTc que chegam até as células infectadas. Essas células ,que possuem o vírus se multiplicando no seu interior, vão manifestar peptídeos virais em cima da seqüência de aminoácidos do MHC-classe 1 (fig.1.4). Esse processo ocorre na hora de sintetizar o MHC-1. Quando a vesícula exocítica contendo as cadeias do MHC-1 recém traduzidas no retículo endoplasmático rugoso estão a caminho da superfície, ocorre uma fusão com uma vesícula contendo peptídeos virais intrínsecos da célula. Então, o MHC-1 chega na superfície contendo esses antígenos virais unidas à sua cadeia de aminoácidos. O receptor CD8 dos LTc se encaixo na MHC-1 lateralmente e o TCR dos LTc reconhece a cadeia estranha e ativa o ataque à célula (ítem 3.2).
Há dois modos de LTc atacarem os vírus:
1- Destruindo as células hospedeiras infectadas, que são fontes das partículas virais replicadas;
2- Liberando de grande quantidade de interferon gama, que embora seja uma molécula reguladora, é também um importante antiviral, pois induz a célula hospedeira a produzir uma proteína antiviral protetora que impede a formação de proteínas virais.
É importante que saibamos que uma célula do nosso organismo que contenha antígenos capsulares de vírus na sua membrana plasmática (como o gp120 do vírus HIV) é reconhecida por linfócitos T citotóxicos ativados, que destróem não só o vírus, mas destroém a célula toda através da liberação de substâncias citolíticas.
RIC (Resposta Imune Celular) contra fungos ou bactérias:
Um infeção por fungos, micobactérias não ocorre diretamente pelo reconhecimento dos linfócitos T citotóxicos, mas sim pela extrema participação dos linfócitos T helpers-1 que, como foi explicado anteriormente, fazem o reconhecimento nas células apres. de ant. e liberam citocinas estimuladoras de LTc. Nos aidéticos, há um défict de LT-helper, e infecções por fungos ocorre frequentemente e de forma mais grave.
Devemos nos lembrar que: com a ativação dos LTh-1 ocorre também a estimulação para a formação de uma clone de células de memórita LTm específicos para o antígeno que vai permanecer sempre no organismo e se manifestar nu
ma resposta imune secundária.
3.2 - Mecanismo de desenvolvimento e de lise celular dos LTc
No timo, formam se linfócitos T que não são ainda capazes realizar a resposta imune. Os LTc que saem no timo apenas são capazes de reconhecer o antígeno ligado ao MHC-classe 1 ou MHC estranho exposto na célula-alvo.
A capacidade de lise celular (ativação) dos LTc é feita pelo contato dos LTc que sairam do timo e o MHC-1 estranho, e por citocinas como IL-2 e interferon gama (e Il-6) liberadas pelos LTh-1 que foram ativados. Quando essas citocinas atingem os LTc ligados ao MHC-1 estranho, vão ativar a diferenciação completa destas células em células capazes de lisar a célula-alvo.
O mecanismo de lise é antígeno específica para o MHC-1 estranho e se baseia na liberação de enzimas que formam poros na
Fig. 1.5 - Esse esquema demostra o ativação para o ataque que ocorre no linfócito T citotóxico. Para a sua ativação, são necessários dois sinais, um vindo da interação MHC-1:TCR-CD3 e o outro pela IL-2 e INF-gama liberado pelos LTh. O mecanismo intrínseco de ativação é igual ao LTh (fig.1.3), visando nesse caso a liberação de perforina e da toxina celular. Os LTc que saem do timo vão aos tecidos linf. secundários (linfonodos...) onde encontram células alvo que foram carreadas pela linfa. O LTc reconhece e ataca a célula. Os LTc podem sair dos linfonodos e ir para o tecido da onde originou a célula estranha. Nesse tecido haverá o ataque as células alvo, da mesma forma que nos tecidos linfóides secundários.
membrana plasmática das células-alvo e as mata por osmose e também pela indução da apoptose ( veja figura 1.5).
Este processo pode ser dividido em etapas:
Etapa 1 : Reconhecimento do antígeno. É a ligação do LTc formado no timo com o MHC-1 estranho e formação do complexo MHC(antígeno)-TCR-CD3.
Etapa 2 : Ativação do LTc. Após o reconhecimento e o contato com as citocinas (INF-gama e Il-2) ocorre a ativação intrínseca do linfócitos mediado pelo CD3 da mesma forma que nos LTh (fig. 1.3.), porém não visa a apenas a produção de citocinas , mas principalmente e a produção de enzimas hidrolíticas e a fosforilação de proteínas de liberação de grânulos lisossômicos por exocitose. O INF-gama é a única citocina importante produzida pelos LTc ativados numa infecção viral.
Etapa 3 : Golpe letal : Com liberação de enzimas como a perforina, ocorre a formação de poros na membrana da célula-alvo. A toxina celular é também liberada.
Etapa 4 : Desligamento do LTc : O LTc se desliga da célula-alvo e se afasta.
Etapa 5 : Morte : A célula alvo contendo poros em sua membrana vai sofrer tumefação osmótica seguido de lise celular e morte. Há também outras substâncias liberadas ou não pelos grânulos como a toxina celular. Essa toxina entra na célula-alvo e ativa enzima da apoptose (morte programa da célula) como a endonuclease, que vai clivar o DNA da célula e fazer rápida condensação da cromatina nuclear.
3.3 - Hipersensibilidade do tipo retardado
A hipersensibilidade do tipo retardado é um forma de resposta mediada por células, em que a célula efetora final é o fagócito-mononuclear (macrófago) ativado. Este tipo de imunidade celular é o mecanismo de defesa primário contra as bactérias intracelulares, como Listeria monocytogenes, micobactérias e Leishmania sp. Essa reação pode ser demonstrada pelo teste intradérmico feito por injeção de antígenos em indivíduo com infecção prévia ou em indivíduos sensibilizados por agentes químicos ou ambientais.
Como resultado dessa reação, ocorre uma inflamação no local com formação de granuloma e a resolução é mediada pelos macrófagos.
Etapas da Hipersensibilidade retardada:
Etapa de sensibilização do indivíduo:
A primeira etapa é uma fase congnitiva, no qual o indivíduo entra em contato pela primeira vez com o antígeno e se torna sensibilizado.
Consiste na fagocitose do antígeno pelo macrófago e a apresentação do antígeno ao LTh-1. A maioria dessa apresentação ocorre nos linfonodos, onde os macrófagos contendo os antígeno chegam até os nodos e os apresentam aos LTh-1. Essas células apres. de ant. produzem IL-1, que junto com o antígeno apresentado vão promover a ativação dos LTh-1 que vão formar IL-2. A IL-2 formada induz a formação de clones de LTh-1 específicos e LT de memória específicos (LTm). Os LTh-1 ativam a resposta imune celular contra o antígeno no local da infecção, através da secração citocinas, até a sua resolução.
A partir daí o indivíduo está sensibilizado pelo resto da vida, devido a permanência dos LTm.
Etapa de ativação da reação de hipersensibilidade retardada :
Quando o indivíduo entra em contato pela segunda vez com o antígeno, estando ele sensibilizado, irá se desenvolver a reação de hipersensibilidade retardada.
Células de Langerhans da pele (ou outra CAA) que permanecem no local de sensibilização entram em contato com produtos bacterianos, como o LPS de gram negativas, parede celular de micobactérias e outros. Este contato faz com que essas células liberem muita IL-1 e FNT que vão recrutar linfócitos para o local. Os Linfócitos de memória que chegam, são apresentados as antígenos pelos macrófagos. A população LT de memória já existente no indivíduo se torna ativada e começa produzir citocinas como a IL-2, INF-gama e TNF que caracterizam a inflamação.
As células endoteliais das vênulas também tem a capacidade de apresentar os antígenos aos LT de memória que cheguem ao local, através da expressão do MHC-classe II. Elas também secretam interferon alfa (INF-alfa) e prostaciclina
Etapa da inflamação:efeito das citocinas
As citocinas realizam os efeitos que caracterizam a reação de hipersensibilidade retardada:
A IL-2 - Induz a proliferação dos LT de memória específicos e de LT não específicos que chegam ao local.
O INF-gama ativa a fagocitose nas células apre. de ant. (macrófagos) e aumenta a expressão do MHC-classe II ampliando a apresentação do antígeno.
TNF estimula as células endoteliais das vênulas a expressarem o receptor de leucócito ICAM-1 que é molécula de adesão para neutrófilos e linfócitos. Essa adesão potencializa o processo de inflamação. O TNF também potencializa a síntese de prostaciclina pelo endotélio, que é uma prostaglandina vasodilatadora. Com isso ocorre uma hiperemia no local. O TNF também é capaz de estimular o endotélio a mudar a conformação da sua membrana basal, permitindo que macromoléculas do sangue extravazem para o tecido. O fibrinogênio que extravaza é a base da enduração presente nos testes intradérmicos.
Etapa final: Resolução da reação
Como foi dito no início deste ítem, os macrófagos são responsáveis pela resolução da reação.
Os monócitos vindos do sangue chegam ao tecido e se diferenciam em macrófagos. Ele é responsável pela fagocitose de bactérias e outros microorganismos ou outros antígenos.
O INF-gama é o principal ativador de macrófagos, estimulando-os a fagocitose, a síntese de receptor FCgamaR (de IgG para opsionização).
A ativação completa do macrófago é feita por produtos bacterianos como LPS ou parede celular das bactérias que agem junto com o INF-gama. Os macrófagos ativados secretam diversas substâncias que vão realizar funções diversas:
- Prostaglandinas e leucotrienos (mediadores da inflamação);
- IL-1 (ativador de linfócitos e fator de proliferação de macrófagos), responsável pela febre e potencializa a inflamação, pois ativa a via ciclo-oxigenase na síntese de prostaglandinas.
- TNF (ampliador da atividade linfocítica)
- GM-CSF (estimulador de colônias) - veja capítulo 1
- PAF (Fator de crescimento derivado de plaquetas). Estimula o crescimento e proliferação de fibroblastos. É responsável também à angiogênese, pois estimula a migração e proliferação de células endoteliais.
-TGF-beta (fator de crescimento transformador-beta). Este fator junto com o PAF é de suma importância para a formação de tecido conjuntivo no local inflamado. Ele ativa formação de colágeno pelos fibroblastos. Por isso na inflamação crônica, com a persistente secreção de TGF-beta e PAF, forma-se fibrose como resultado de resolução feita pelo macrófago.
Testes intradérmicos Tipo PPD
PPD é um tipo de teste no qual é injetado um antígeno intradermicamente no indivíduo para detectar a sensibilidade daquele paciente ao antígeno, ou seja , testa a sua capacidade de resposta imune celular a partir dos LT de memória observando na pele uma enduração (granuloma). A presença dessa enduração e o seu tamanho vão indicar o nível de sensibilidade.
O antígeno do PPD é um Derivado Proteico Purificado , obtido de um caldo de cultura onde cresceram Mycobacterium tuberculosis, aquecido, filtrado e diluído.
A injeção intradérmica (de 0,1 mL) é feita na face ventral do antebraço dentro da derme . Aparecerá uma resposta imune de hipersensibilidade tardia na pele de indivíduos que já tiveram contato com o bacilo de Kock. Esse contato é feito de várias formas, como a vacina BCG ou contato com o bacilo (pessoas que já tiveram tuberculose), no qual o indivíduo desenvolveu uma sensibilização do seu sistema imune e formou LT de memória. Pessoas que estão com tuberculose dão uma reação tão forte que chega a necrosar a região do braço aplicada com a injeção. Veja figura 1.6
Fig. 1.6 - Este esquema ilustra o principal mecanismo imunológico que ocorre numa reação de hipersensibilidade como o PPD. Com a inoculação do antígeno, estando o indivíduo sensibilizado (com LTm formados), o macrófago é e as células endoteliais das vênulas apresentam o antígeno aos LTm, que vão se ativar e secretar ativamente as citocinas, entre ais quais estão o TNF, INF-gama e IL-2. O TNF altera a membrana basal do endotélio, deixando estravazar proteínas (fibrinogênio) para tecido e também estimula a síntese de PGE2 na vênula. A PGE2 é um vasodilatador, fazendo elevar o fluxo sangüíneo no local. O INF-gama ativa macrófagos e a IL-2 estimula a proliferação dos LTm específicos existentes. O macrófago ativado produz IL-1 e mais TNF, que juntos, atraem mais linfócitos ao local.
Cerca de 4 horas após e injeção, neutrófilos se acumulam na vênulas no local de injeção e algumas horas depois esse infiltrado desaparece. 12 horas após a injeção, monócitos chegam ao local e viram macrófagos, que começam a apresetação do antígeno aos LTm. Inicia-se a ativação violenta de LTm que vão recrutar grande população de linfócitos até o local. Essas células se localizam ao redor das vênulas da derme e iniciam a inflamação local através da secreção de citocinas (descrita anteriormente). O fibrinogênio escapa dos vasos (por ação do TNF) e na derme é convertido à fibrina. A fibrina em grande quantidade, unida às células (monócitos, macrófagos, linfócitos, células de Langehans...) na derme em volta das vênulas dão o aspecto intumescido (endurado) na região do braço. Esse aspecto só aparece por volta de 18 horas após a injeção, sendo máxima por volta de 12-24 horas (esse intervalo até apacer o endurescimento que dá o nome a reação-retardada). Macrófagos em grande número vão resolver a reação que o braço volte o que era antes.
A interpretação clínica do endurado é feito da seguinte forma :
- Ausente ou até 4 mm - NÃO REATOR. Não apresenta proteção, ou seja, não tem LTm contra antígenos do bacilo.
- 5 a 7mm - REATOR FRACO. Proteção contra tuberculose, ou seja , existe LTm formados que confere ao indivíduo uma boa resposta imune secundária se ele tiver contato outra vez com o bacilo. Com certeza, ou indivíduo foi vacinado com BCG ou já teve alguma forma de tuberculose.
- 8mm ou necrose - REATOR FORTE. Suspeita-se de infecção ativa da tuberculose, pois a reação é extremamente forte, o indivíduo deve estar com uma população de linfócitos T ativos, levando até a uma necrose na região do braço.
Pacientes que estão com tuberculose comprovada e são anérgicos, ou seja, não reatores no teste PPD, possuem alguma deficiência de linfócitos T (ou até AIDS grave) ou estão tomando alguma droga imunossupressora. Esses pacientes estão em situação mais grave, e a doença pode evoluir rapidamente e até levar a morte.
Há vários outros agentes infecciosos, como os fungos, que se faz o teste tipo PPD usando o antígeno extraído da cultura do fungo.Ex:
Coccidioides immitis - Coiccidiodina é o antígeno extraído de cultura. A enduração aparece na pele em 24-48 horas após a aplicação. Se o resultado for negativo, tem duas opcões: ou a suspeita está errada, ou a doença está na forma disseminada. 15% dos pacientes apresentam eritrema nodoso na pele por hipersensibilidade tardia sem a inoculação do antígeno. Isso ocorre porque antígenos do fungo atingem a derme por via hematogênica e ativam a reação. Estando o paciente com baixa resposta imune celular (anergia) e infectado com o fungo, haverá uma intensa proliferação desse agente no organismo (septicemia) incluindo derrame plueral, pneumonia etc. , podendo até levar à morte.
Histoplasma capsulatum - o teste é feito com histoplasmina extraído da cultura. Sendo negativo, há possibilidade de disseminação (baixa RIC) para o baço, fígado, nariz, boca, intestino.
Blastomyces dermatidis - antígeno blastomicina. O teste PPD é positivo em 50% dos casos devido a baixa especificidade do teste.
Paracoccidioides brasiliensis - antígeno paracocidioidina, sendo positivo na maioria dos pacientes com paracoccidioidomicose. O resultado negativo leva a hipótese de disseminação para o baço, fígado, mucosas e pele, formando granulomas (inflamação crônica) nesses locais.
Na Hanseníase ("lepra") também é feito teste intradérmico de forma semelhante ao PPD, entretanto o antígeno é de Micobacterium leprae. Esse antígeno é denominado de antígeno Mitsuda. Como não há ainda um modo de cultivar essas bactérias em meio de cultura, o Mitsuda é obtido de lepromas fervidos, homogeinizados em solução salina durante 60 minutos, centrifugado em Milipore e adicionado fenol a 0,5%.
O teste é realizado injetando-se 0,1 mL do antígeno na face ventral do antebraço e a leitura da reação é feita após 21 dias.
Com esse teste é possível saber se o paciente tem a forma tuberculóide, wirchoviana ou negativa.
Na forma tuberculóide detectamos a enduração no braço, pois o indivíduo tem boa resposta imune celular. Explicaremos a seguir o motivo pelo qual isso ocorre:
Na forma tuberculóide, o paciente possui uma forma de resistência, que é devido a sua população de LTh-1ou LTh-1 de memória produzindo interferon gama e interleucina 2 que, como vimos anteriormente, inicia a reação imune celular . Com a RIC, esse paciente consegue freiar o desenvolvimento da população de bacilos, pois os macrófagos ativados vão fagocitá-los. Então haverá o endurescimento na pele por ativação dos LTh-1.
Na forma lepromatosa ou wirchoviana, o paciente não tem resistência, que é devido a sua população de LTh-2, que como vimos antes, produz IL-4 e IL-10. A IL-4 inibe o interferon gama e a IL-10 inibe a expansão clonal dos LTh-1 e LTh-1m. Então não ocorre nem o início da RIC e o indívíduo fica sem resposta, havendo proliferação de bacilos dentro dos macrófagos, sendo estes incapazes de realizar a digestão intracelular pela ausência de INF-gama. Por isso a reação de Mitsuda é negativa (sem reação).
A reação pode esta ausente em pessoas que não tem a doença, e não formou linfócitos específicos contra o bacilo.
